--- titulo: Análisis microbiológico del agua descripcion: Recoger muestras estériles, prueba H2S casera y recuento de E. coli con incubación: clasificar el riesgo fecal y verificar el tratamiento. nivel: 3 estado: borrador requisitos: [] relacionados: [01-agua-y-saneamiento/potabilizacion/analisis-basico-de-calidad-del-agua, 01-agua-y-saneamiento/potabilizacion/hervido-del-agua, 01-agua-y-saneamiento/potabilizacion/desinfeccion-solar-sodis, 01-agua-y-saneamiento/potabilizacion/desinfeccion-quimica-del-agua-con-cloro-y-yodo, 01-agua-y-saneamiento/potabilizacion/filtro-lento-de-arena-y-biofiltro-de-carbon, 01-agua-y-saneamiento/potabilizacion/filtros-de-ceramica-y-carbon] fuentes: - "Sobsey, M.D.; Pfaender, F.K. Evaluation of the H2S Method for Detection of Fecal Contamination of Drinking Water. OMS, WHO/SDE/WSH/02.08, 2002." - "Manja, K.S.; Maurya, M.S.; Rao, K.M. A simple field test for the detection of faecal pollution in drinking water. Bulletin of the WHO 60(5): 797-801, 1982." - "Pillai, J.; Mathew, K.; Gibbs, R.; Ho, G.E. H2S paper strip method: a bacteriological test for faecal coliforms in drinking water at various temperatures. Water Science and Technology 40(2): 85-90, 1999." - "OMS. Guidelines for Drinking-water Quality, 4.ª ed. con addenda 1 y 2, Ginebra, 2022. Cap. 4, 5 y 7." - "OMS. Guidelines for Drinking-water Quality, 2.ª ed., vol. 3: Surveillance and control of community supplies. Ginebra, 1997." - "WHO/UNICEF JMP y UNICEF MICS. Módulo de análisis de calidad del agua en encuestas de hogares. washdata.org; mics.unicef.org." - "Aquagenx. Compartment Bag Test (CBT): instrucciones e Incubation Period Guidance." - "APHA/AWWA/WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 23.ª ed., 2017. Métodos 9040, 9060 A y 9222." - "Aquaya Institute. Best Practices: Sample Holding Times for Microbial Water Analysis." --- # Análisis microbiológico del agua ## Resumen Este artículo explica cómo averiguar si un agua lleva **contaminación fecal** y cómo comprobar que un tratamiento la elimina. Incluye la toma de muestras estériles con su conservación, la **prueba H2S de presencia-ausencia** con un medio que se prepara en un taller con química básica (N3) y el **recuento de *E. coli*** en UFC/100 mL con kit o filtración en membrana (N4). El resultado es una clasificación de riesgo por fuente (< 1, 1-10, 11-100 y > 100 *E. coli*/100 mL) y la prueba de que el agua tratada sale **negativa**. Complementa al [análisis básico](analisis-basico-de-calidad-del-agua.md), que cubre inspección, turbidez, cloro, pH, sales y química. Un análisis negativo no demuestra que el agua sea inocua: solo reduce la incertidumbre. ## Requisitos previos - **Conocimientos:** inspección sanitaria de la fuente y turbidez ([análisis básico](analisis-basico-de-calidad-del-agua.md)); nociones de higiene y de manejo de la olla a presión. - **Materiales para la toma de muestras (N3):** frascos de vidrio de 150-250 mL con tapón de rosca que aguante el calor, o bolsas estériles; papel de aluminio; tiosulfato sódico al 10 % si el agua está clorada; nevera portátil con acumuladores de frío; etiquetas y cuaderno. - **Materiales para la prueba H2S (N3):** peptona bacteriológica, fosfato dipotásico, citrato férrico amónico, tiosulfato sódico, detergente aniónico, agua destilada, papel absorbente y frascos de 30-40 mL. - **Materiales para el recuento (N4):** kit comercial (bolsas CBT o placas cromogénicas) o equipo de filtración con membranas de 0,45 µm, portafiltros, bomba de vacío manual, pinzas y medio selectivo. - **Incubación:** calor corporal o caja aislada con botella de agua tibia (25-37 °C, H2S y CBT); caja de poliestireno con bombilla y termómetro (35-37 °C); baño de agua o incubadora con termostato de ±0,5 °C (44 °C). Termómetro de 0-60 °C en todos los casos. - **Herramientas:** olla a presión (N3), mechero de alcohol (N2), lupa de ×5-10 (N2). - **Tiempo y personas:** preparar 50 frascos de H2S lleva una jornada de 2 personas. Tomar una muestra, 10 min. Montar una prueba H2S, 5 min, y leerla, 12-48 h. Un recuento de *E. coli*, 20-48 h. ## Principio de funcionamiento ### Indicadores fecales Las enfermedades del agua (cólera, disentería, fiebre tifoidea, hepatitis A, giardiasis) vienen casi siempre de heces. Buscar cada patógeno es imposible en el campo, así que se busca un **indicador**: una bacteria intestinal muy abundante cuya presencia demuestra contaminación fecal reciente. El de referencia es *Escherichia coli*, y los **coliformes termotolerantes** (crecen a 44 °C) son una aproximación aceptable. La OMS exige que no se detecten en 100 mL de agua de consumo (OMS 2022, cap. 7). Los «coliformes totales» no sirven como indicador fecal, porque muchos viven en el suelo. La ausencia de *E. coli* no garantiza la ausencia de virus ni de quistes de *Cryptosporidium* y *Giardia*, que resisten más. Además, una muestra es la foto de un instante y la contaminación sube tras las lluvias. Por eso el análisis se combina con la inspección sanitaria. ### Prueba H2S Muchas bacterias intestinales (*Salmonella*, *Citrobacter*, *Proteus*, *Clostridium perfringens*) reducen el tiosulfato del medio a sulfuro de hidrógeno. Este reacciona con el hierro del citrato férrico amónico y forma **sulfuro de hierro negro**. La prueba cuesta del orden del 20 % de un análisis de coliformes y no necesita incubadora si hace calor, pero **no es específica**. Las bacterias sulfatorreductoras no fecales, habituales en pozos y en tuberías de hierro, también la ennegrecen: en laboratorio, 4 de 16 cultivos de estas bacterias dieron positivo (Sobsey y Pfaender 2002, §3.3). También la ennegrecen los sulfuros naturales del agua subterránea. La revisión de la OMS concluye que, **si la alternativa es no analizar**, se recomienda usarla con cautela, y que no se ha evaluado en climas fríos (cap. 4). Sus errores suelen ser falsos positivos, que pecan de prudentes. ### Recuento e incubación En los medios cromogénicos, una enzima propia de *E. coli* (β-glucuronidasa) libera un color, de modo que cada colonia o compartimento teñido indica *E. coli*. En la filtración en membrana, las bacterias de 100 mL quedan retenidas en un filtro de 0,45 µm y cada una forma una colonia visible sobre el medio. La temperatura selecciona: a 44 °C solo crecen bien los coliformes termotolerantes, sobre todo de origen fecal. Las bacterias estresadas por cloro, sol o frío se recuperan peor, y de ahí la fase de resucitación antes de subir a 44 °C. ## Procedimiento ### A. Frascos, toma y conservación de muestras 1. **Prepara los frascos:** limpios, con el tapón flojo y la boca tapada con papel de aluminio. Esterilízalos en la olla a presión 15-20 min a plena presión (≈121 °C), o 30 min si la olla no llega a 1 bar. Otra opción es el horno a 170 °C durante al menos 60 min (SM 9040), o 2 h si el termostato no es fiable. Si el agua está clorada, añade antes **0,1 mL de tiosulfato sódico al 10 % por cada 120 mL** de frasco (SM 9060 A). Marca una raya a 100 mL. *Criterio de éxito:* frascos cerrados, secos por dentro y con el envoltorio intacto. 2. **Grifo o bomba:** quita filtros y mangueras, limpia la boca del grifo y deja correr el agua 1-2 min. Cierra y flamea la boca 1 min con un algodón empapado en alcohol (si es de plástico, frótala con lejía diluida). Abre y deja correr 1-2 min a caudal medio (OMS 1997, vol. 3). *Criterio de éxito:* caudal continuo antes de llenar. 3. **Pozo abierto, depósito o río:** sujeta el frasco por la base con las manos lavadas, o átalo a una cuerda con un peso limpio. Destápalo sin tocar el interior del tapón, sumérgelo boca abajo a 20-30 cm y gíralo boca arriba contra la corriente. **Agua almacenada en casa:** tómala como la sirve la familia, con su cazo o su grifo. *Criterio de éxito:* frasco lleno hasta la marca, con 2-3 cm de aire y tapado en menos de 5 s. 4. **Etiqueta** con el código, la fuente, el punto exacto, la fecha, la hora, la lluvia de las últimas 48 h y el cloro residual medido en ese momento. *Criterio de éxito:* la misma información en el frasco y en el cuaderno. 5. **Conserva** a oscuras en la nevera portátil, **por debajo de 10 °C** y sin congelar. **Analiza antes de 6 h**, o como máximo en 24 h a 4-10 °C (OMS, citado por Aquaya). Una muestra caliente o de más de 24 h no vale: repítela. *Criterio de éxito:* hora de análisis anotada. ### B. Prueba H2S de presencia-ausencia (N3) **Medio de Manja et al. (1982)**, para unos 50 frascos de 20 mL: | Componente | Cantidad | |---|---| | Peptona bacteriológica | 20 g | | Fosfato dipotásico (K₂HPO₄) | 1,5 g | | Citrato férrico amónico | 0,75 g | | Tiosulfato sódico | 1 g | | Detergente aniónico líquido (Teepol en el original) | 1 mL | | Agua destilada | 50 mL | 1. **Disuelve** los componentes en el agua templada (≈40 °C), removiendo. Si no hay Teepol, usa un detergente aniónico sin lejía ni perfume y valida cada lote con controles negativo y positivo. *Criterio de éxito:* líquido pardo sin grumos. Hay variantes publicadas con L-cistina para ganar sensibilidad. Venkobachar et al. (1994) usaron 0,25 g por litro de su medio concentrado, que equivale a ≈12,5 mg para estos 50 mL. Manja et al. (2001) añadieron 250 mg de L-cisteína al medio original y secaron a 60 °C durante 2 días (ambos citados por Sobsey y Pfaender 2002). 2. **Impregna el papel:** empapa con **1 mL** de medio una tira doblada de papel absorbente de unos 80 cm² y métela en un frasco de 30-40 mL con una marca a 20 mL. *Criterio de éxito:* papel teñido de forma uniforme y sin líquido sobrante. 3. **Esteriliza y seca:** esteriliza con el tapón flojo en la olla a presión (15-20 min a plena presión; 30 min si la olla no llega a 1 bar) y seca 1-2 días a ≈50 °C. Cierra, rotula lote y fecha, y guarda a oscuras. *Criterio de éxito:* papel seco y pardo. 4. **Siembra:** añade la muestra hasta la marca de 20 mL, cierra y agita 10 s. Existe una versión de 100 mL con 5 mL de medio que es más sensible (Pillai et al. 1999). *Criterio de éxito:* papel sumergido. 5. **Descarta interferencias:** mira el frasco **a los 15 min y a la hora**. Si ya ennegrece, el color viene del sulfuro o el hierro del agua y no de bacterias. El resultado es **no interpretable**: airea otra muestra agitándola 1 min en un frasco medio lleno y repite, o usa el recuento de *E. coli*. *Criterio de éxito:* sin cambio de color en la primera hora. 6. **Incuba a 25-37 °C.** Por debajo de 20 °C el resultado no es fiable: no se ha evaluado en climas fríos (Sobsey y Pfaender 2002, cap. 4) y Pillai et al. (1999) la validaron entre 20 y 44 °C. Sin incubadora, usa el calor corporal (frasco bien cerrado dentro de una bolsa estanca, en un bolsillo interior) o una caja aislada con una botella de agua tibia, y comprueba la temperatura con el termómetro. *Criterio de éxito:* temperatura anotada al inicio y en cada lectura. 7. **Lee:** a 30-37 °C, a las 12-18 h (Manja 1982) y confirmación a las 24 h; a 25-30 °C, a las 24 y a las 48 h. **Negro** (en el papel o en el líquido, aunque sea parcial) = **positivo**. **Negativo** = sin ennegrecer a las 48 h a ≥ 25 °C. En cada lote incluye un control negativo (agua hervida 1 min y enfriada tapada) y otro positivo (agua de charca). *Criterio de éxito:* los dos controles dan lo esperado. **Interpretación:** Manja validó la prueba con aguas de ≥ 10 coliformes totales/100 mL (NMP), que consideró no satisfactorias. Un positivo equivale aproximadamente a ese nivel. Un positivo en un pozo que huele a huevo podrido o con tuberías de hierro oxidadas puede ser falso: confírmalo con *E. coli*. **Un negativo no permite dejar de tratar** un agua superficial ni una fuente con riesgos en la inspección: ante la duda, trata. ### C. Recuento de E. coli o coliformes termotolerantes (N4) 1. **Elige el método:** - **Bolsa de compartimentos (CBT) o sustrato cromogénico:** se añade el medio a 100 mL de muestra, se reparte en compartimentos y se incuba. Los compartimentos que cambian de color dan el número más probable (NMP) de *E. coli* por 100 mL. Incubación según el fabricante: 35-37 °C, 20 h; 31-34 °C, 24-30 h; 25-30 °C, 40-48 h. Por encima de 45 °C el crecimiento empeora (Aquagenx). - **Filtración en membrana:** coliformes termotolerantes en caldo lauril sulfato (MLSB) a 44 ± 0,5 °C, 18-24 h (colonias amarillas; método Oxfam-DelAgua, OMS 1997, vol. 3), o en m-FC a **44,5 ± 0,2 °C, 24 ± 2 h** (colonias azules; SM 9222 D). *E. coli* en medio cromogénico: 35-37 °C, 18-24 h. *Criterio de éxito:* método, medio e incubación decididos antes de salir a muestrear. 2. **Elige el volumen:** 100 mL para agua tratada. Para agua bruta o de riesgo alto, filtra además 10 mL y 1 mL, completados a ≥ 20 mL con agua estéril. Para termotolerantes, la placa se cuenta bien con **20-60 colonias** (SM 9222). *Criterio de éxito:* al menos un volumen con colonias contables. 3. **Filtra:** desinfecta la mesa con alcohol, flamea las pinzas y monta el portafiltros esterilizado. Coloca la membrana con la cuadrícula hacia arriba, vierte la muestra agitada, aplica vacío y enjuaga con 20-30 mL de agua estéril. Pasa la membrana a la placa de medio sin dejar burbujas. *Criterio de éxito:* membrana plana y en contacto con el medio en toda su superficie. 4. **Resucita e incuba:** con MLSB, deja la placa **1-4 h a temperatura ambiente** antes de pasarla a 44 °C (OMS 1997, vol. 3). Incuba boca abajo. A 44 °C hace falta un control de ±0,5 °C: baño de agua con termostato e incubadora de campo. A 35-37 °C basta una caja de poliestireno con una bombilla incandescente de 15-25 W, ajustada mirando el termómetro. Con calor corporal (≈30-35 °C, placa o bolsa bien cerradas dentro de otra bolsa estanca), alarga el tiempo según el paso 1. *Criterio de éxito:* temperatura registrada al inicio, a mitad y al final, dentro del rango. 5. **Cuenta** las colonias características, con la lupa si hace falta, o los compartimentos positivos. UFC/100 mL = colonias × 100 / mL filtrados (ver «Cálculos»). *Criterio de éxito:* resultado anotado junto con el volumen usado. 6. **Clasifica** según las categorías de riesgo de OMS/UNICEF (JMP): | *E. coli* por 100 mL | Riesgo | Acción | |---|---|---| | < 1 (no detectado) | Bajo | Cumple la guía de la OMS. Mantener tratamiento y vigilancia | | 1-10 | Moderado | Tratar siempre en casa; revisar la inspección sanitaria | | 11-100 | Alto | Tratamiento obligatorio y verificado; corregir la fuente con prioridad | | > 100 | Muy alto | Clarificar y desinfectar; buscar fuente alternativa; avisar a los usuarios | *Criterio de éxito:* cada fuente con su categoría y su acción. En agua tratada, cualquier *E. coli* es un fallo del tratamiento o del almacenamiento: investígalo en seguida. ### D. Frecuencia y puntos de muestreo 1. **Primera evaluación:** analiza en época de lluvias o tras una lluvia fuerte, que es el peor caso. *Criterio de éxito:* al menos un resultado por fuente en esas condiciones. 2. **Rutina** (criterio práctico del artículo; la OMS solo fija mínimos para redes): | Pozo o manantial comunitario | Tratamiento doméstico | Red con cloración | |---|---|---| | Mínimo 2-4 análisis al año, incluidas las lluvias | Al empezar con un método y luego cada 1-3 meses en una muestra de hogares | OMS: < 5000 habitantes, 12 muestras al año; 5000-100 000, 12 por cada 5000 habitantes | 3. **Puntos:** la fuente, la salida del tratamiento y el punto de consumo (grifo público o recipiente del hogar, que es donde más contaminación aparece). *Criterio de éxito:* cada campaña cubre los tres niveles. ## Verificación - **Esterilidad y medios:** en cada lote, el blanco (agua hervida 1 min y enfriada tapada) debe dar negativo y el control positivo (agua de charca) debe dar positivo. Si el blanco sale positivo, se descartan los resultados de ese lote. - **Del tratamiento:** la prueba que cuenta es agua bruta positiva y agua tratada **negativa** en la misma jornada, repetida al menos 3 veces en semanas distintas. - **De la temperatura:** registra máxima y mínima de cada incubación; si se sale del rango, repite. - **Con más medios:** duplica una de cada 10 muestras y envía otra a un laboratorio acreditado para comparar. ## Errores frecuentes | Síntoma | Causa probable | Solución | |---|---|---| | H2S negro en menos de 1 h | Sulfuro o hierro del propio agua | No interpretable: airear otra muestra o usar *E. coli* | | H2S positivo en un pozo que siempre da 0 *E. coli* | Bacterias sulfatorreductoras o sulfuro natural | Confirmar con *E. coli*; revisar tuberías de hierro | | H2S negativo en agua de charca | Frío, lectura precoz, medio caducado o recalentado | Incubar a ≥ 25 °C hasta 48 h; control positivo en cada lote | | Blanco positivo | Frascos mal esterilizados o manos | Revisar la olla, no tocar bocas ni tapones, flamear pinzas | | Placa llena de colonias incontables | Volumen excesivo para agua muy contaminada | Filtrar también 10 mL y 1 mL | | *E. coli* en agua clorada con residual correcto | Contaminación al tomar la muestra | Flamear el grifo, dejar correr y repetir con técnica estéril; si persiste, revisar el tratamiento | | 0 *E. coli* en agua clorada que llegó con cloro activo | Frasco sin tiosulfato: el cloro siguió actuando | Añadir tiosulfato a los frascos para agua clorada | | Todo negativo en muestras llevadas al día siguiente sin frío | Muerte de bacterias en el transporte | Menos de 10 °C y analizar antes de 6 h (máximo 24 h) | | Pocas colonias a 44 °C en agua clorada o soleada | Bacterias estresadas sin resucitar | 1-4 h a temperatura ambiente antes de subir a 44 °C | ## Seguridad - **Cultivos.** Un frasco H2S negro o una placa positiva contienen **millones de bacterias fecales, posiblemente patógenas**. No abras los frascos incubados salvo para desecharlos: al aire libre y apartando la cara, añade 5-10 mL de lejía doméstica, vuelve a cerrar, espera 30 min y luego entierra a más de 30 m de cualquier fuente o quema. Usa guantes o lávate las manos con jabón después de cada manipulación. No comas ni bebas en la zona de análisis y tapa las heridas de las manos. Si se derrama un cultivo, cúbrelo con papel, empápalo en lejía diluida 1:10, espera 15 min y limpia. Si aparecen diarrea acuosa abundante o sangre en heces, inicia la rehidratación oral y busca atención médica. - **Olla a presión.** Puede reventar o soltar vapor a 121 °C. Mantén la válvula limpia, no la llenes más de 2/3 y no la abras hasta que la presión haya bajado del todo. Si hay una quemadura, agua fría durante 20 min. - **Flameado con alcohol.** El alcohol arde con una llama casi invisible a la luz del día. Mantén la botella cerrada y lejos, ten a mano un recipiente con agua para apagar las pinzas y recógete el pelo. Nunca rellenes un mechero encendido. - **Toma de muestras.** Los pozos abiertos y las orillas causan ahogamientos. Trabaja en pareja, no te asomes sin sujeción y no bajes nunca a un pozo, que puede acumular CO₂ o H₂S. En ríos crecidos, usa una pértiga. - **Reactivos.** Guárdalos rotulados y lejos de alimentos y niños. Si salpican a los ojos, lava con agua abundante durante 15 min. ## Variantes - **Con menos recursos (N2-N3):** la prueba H2S con incubación por calor corporal es la opción más barata. Sin peptona ni citrato férrico no hay prueba fiable. Se pierde la verificación y hay que **tratar toda el agua** que no sea de lluvia recogida limpia o de un manantial bien protegido. - **Con más recursos (N4):** kits CBT o placas cromogénicas; filtración en membrana con incubadora de campo de 44 °C a batería, que permite 10-20 muestras al día por técnico; laboratorio local con NMP. - **Escalado:** - **Familia:** una prueba H2S o CBT al empezar a usar un tratamiento y tras cambios de fuente. - **Aldea:** un promotor con frascos H2S por lotes controlados (blanco y positivo) que envía muestras de *E. coli* cada mes a la cabecera, más un tablero público con la categoría de cada fuente. - **Ciudad:** laboratorio con técnicos, muestreo según población (tabla D) y resultados cruzados con los brotes de diarrea. ## Cálculos **1. UFC por 100 mL.** Se filtran 10 mL de agua de río y salen 34 colonias azules. UFC/100 mL = 34 × 100 / 10 = **340 UFC/100 mL** → riesgo muy alto. Si con 1 mL salieron 3 colonias (≈300 UFC/100 mL), los dos resultados son coherentes. **2. Tiosulfato para los frascos.** A 0,1 mL por frasco de 120 mL, 50 frascos necesitan 5 mL de solución al 10 %: disuelve 1 g de tiosulfato sódico en agua destilada hasta 10 mL. ## Fuentes - Sobsey, M.D.; Pfaender, F.K. *Evaluation of the H2S Method for Detection of Fecal Contamination of Drinking Water*. OMS, WHO/SDE/WSH/02.08, 2002. §3.3, §3.5 (tabla 3) y cap. 4. - Manja, K.S.; Maurya, M.S.; Rao, K.M. «A simple field test for the detection of faecal pollution in drinking water». *Bulletin of the WHO* 60(5): 797-801, 1982. - Pillai, J. et al. «H2S paper strip method: a bacteriological test for faecal coliforms in drinking water at various temperatures». *Water Science and Technology* 40(2): 85-90, 1999. - OMS. *Guidelines for Drinking-water Quality*, 4.ª ed. con addenda 1 y 2, 2022. Cap. 4, 5 y 7. - OMS. *Guidelines for Drinking-water Quality*, 2.ª ed., vol. 3: *Surveillance and control of community supplies*, 1997. - WHO/UNICEF JMP y UNICEF MICS. Módulo de calidad del agua. washdata.org; mics.unicef.org. - Aquagenx. *Compartment Bag Test* e «Incubation Period Guidance». - APHA/AWWA/WEF. *Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater*, 23.ª ed., 2017. 9040, 9060 A y 9222. - Aquaya Institute. «Best Practices: Sample Holding Times for Microbial Water Analysis».